壬基酚对雄性SD大鼠生殖系统功能的影响

【摘要】目的：壬基酚（nonylphenol，NP）是一种广泛使用的化工原料，主要用于合成洗涤剂、造纸、纺织印染、皮革化工、乳液聚合、农药等工业领域。随着经济的飞速发展，我国每年都有大量的壬基酚通过工业“三废”及生活污水进入环境介质。壬基酚具有拟雌激素活性，是典型的环境内分泌干扰物。环境中极低浓度的壬基酚即可通过生物蓄积效应和食物链传递，潜在危害生物体的内分泌、生殖、免疫、神经等多个系统机能。目前，关于雄性动物成年期壬基酚染毒对生殖器官、性激素水平及精子受精功能影响的研究较少，特别是精子顶体相关指标、附睾抗氧化状态及凋亡等方面的研究尚未见报道。本课题通过对成年雄性SD大鼠灌胃染毒，研究壬基酚对大鼠睾丸、附睾和精子的损伤作用，探讨其对雄性大鼠生殖功能的影响及其可能的毒作用机制。方法：32只健康成年SPF级雄性SD大鼠，经适应性饲养1周后，按体重随机分为4组：溶剂对照组（玉米油）和低（40mg/kg）、中（100mg/kg）、高剂量（250mg/kg）壬基酚染毒组，每组8只。从大鼠12周龄开始，采取灌胃方式染毒，容量1.5ml/kg，隔天上午染毒1次，连续90d。（1）一般状况及体重：每日观察动物的饮食和活动情况，注意大鼠被毛、皮肤、眼睛、呼吸以及日常行为方面的变化。隔天称重一次；（2）大鼠处死后，分离双侧睾丸、附睾和附睾尾，称重，并计算相应的脏器系数；（3）苏木素-伊红（HE）染色，观察大鼠睾丸组织病理学改变；（4）腹主动脉采血，分离血清，酶联免疫吸附法（ELISA）检测血清睾酮水平；（5）制备附睾尾精子悬液，利用光学显微镜及活细胞工作站，计数精子浓度、畸形率和活动度；（6）通过使用相应荧光探针和流式细胞技术检测精子存活率、顶体完整性、线粒体膜电位（MMP）和游离钙离子（[Ca2+]i）水平；（7）采用改良Kenndy法检测精子顶体酶活性；（8）通过流式细胞仪和荧光染料（H2DCFDA）检测附睾尾精子活性氧（ROS）水平；（9）利用酶联免疫吸附法检测附睾组织抗氧化物酶（（超氧化物歧化酶，SOD）和（过氧化氢酶，CAT））活性；（10）使用TUNEL法评估壬基酚对附睾凋亡诱导效应。结果：（1）染毒后，各剂量壬基酚染毒组大鼠均出现精神萎靡、稀便、被毛不舒展、毛发灰暗甚至脱毛现象，组间差异不明显。高剂量组大鼠在灌胃时反抗较强烈，攻击性行为在染毒后期明显增强。各染毒组大鼠体重与溶剂对照组比较，差异均无统计学意义。（2）与溶剂对照组比较，仅低、高壬基酚染毒组大鼠的附睾重量显著下降。各染毒组大鼠睾丸、附睾和附睾尾的脏器系数与溶剂对照组比较，差异均无统计学意义。（3）病理学检查发现，溶剂对照组大鼠睾丸曲细精管排列紧密、结构完整，生精上皮基膜完整，各级生精细胞层排列规则、层次清楚；低剂量壬基酚染毒组曲细精管结构相对规则、大小一致，管间隙略有增大，生精细胞层基本完整；中、高剂量壬基酚染毒组睾丸出现部分曲细精管萎缩、管间隙增大，生精细胞层变薄、结构排列紊乱，管腔内精子细胞数量减少，部分管腔可见脱落的上皮细胞碎片。（4）与溶剂对照组比较，低剂量壬基酚染毒组大鼠血清睾酮水平略有升高，中、高剂量组睾酮水平有所降低，但仅高剂量组睾酮水平降低明显，差异有统计学意义。（5）附睾尾精子计数、活动度随着染毒剂量的增加而逐渐降低，而精子畸形率随着染毒剂量的增加而逐渐升高。与溶剂对照组比较，中、高剂量壬基酚染毒组大鼠附睾尾精子数量显著减少、活动度显著降低、畸形率显著增加。（6）流式细胞仪检测结果显示，与溶剂对照组比较，中、高剂量壬基酚染毒组精子的（PI-/PNA+）%明显升高；高剂量壬基酚染毒组大鼠精子hMMP%显著降低；各剂量壬基酚染毒组大鼠精子存活率和[Ca2+]i水平均无明显变化；随壬基酚染毒剂量的升高，精子顶体完整性和MMP的水平呈逐渐降低的趋势。（7）与溶剂对照组比较，高剂量壬基酚染毒组精子的顶体酶活力下降，差异有统计学意义；随着壬基酚染毒剂量的升高，精子顶体酶活力呈逐渐降低的趋势。（8）与溶剂对照组比较，壬基酚染毒组大鼠精子细胞内ROS水平均有所升高，但仅高剂量组精子ROS显著升高。（9）与溶剂对照组比较，壬基酚染毒组大鼠附睾组织SOD和CAT活性均有所下降，其中低、高剂量组CAT活性以及高剂量组SOD活性均显著下降。（10）TUNEL检测结果显示：各组大鼠附睾组织均见凋亡阳性信号表达，且凋亡细胞主要是退化的附睾管上皮细胞，位于附睾管基底部；与溶剂对照组比较，低、高剂量壬基酚染毒组大鼠附睾组织凋亡阳性细胞百分比显著升高；高剂量组附睾组织凋亡阳性细胞显色强度呈强阳性，其余剂量组凋亡阳性细胞显色强度呈阳性。结论：（1）壬基酚于大鼠成年期在体暴露，可使附睾重量明显下降，提示壬基酚对附睾组织存在损害作用；同时壬基酚染毒对大鼠体重和睾丸重量则未显现出明显的影响。（2）组织病理学检查提示，随壬基酚染毒剂量的增加，睾丸曲细精管损伤程度逐渐加重。（3）壬基酚可导致血清睾酮水平明显降低，提示壬基酚能扰乱内分泌激素水平，从而对雄性生殖系统产生毒性作用。（4）壬基酚暴露可使大鼠附睾尾精子数量显著减少、畸形率显著增加，提示壬基酚可能造成成年雄性生精障碍。（5）壬基酚暴露可影响精子活动度、MMP、顶体完整性及顶体酶活性，表明壬基酚对精子受精功能具有一定损伤作用；但是壬基酚对精子存活率和[Ca2+]i没有明显的影响作用，提示NP对精子受精功能的影响可能不是通过改变[Ca2+]i水平而发挥作用的。（6）壬基酚暴露可升高大鼠附睾尾精子ROS水平，造成精子氧化应激增加。提示，壬基酚所致精子ROS增加可能是影响精子受精功能的机制之一。（7）壬基酚暴露可影响附睾组织SOD和CAT活性，也可诱导附睾组织发生凋亡。提示壬基酚对附睾组织具有一定毒性，可能是造成脏器重量降低及精子功能变化的原因之一。
【作者】陆维晨；
【导师】田海林；
【作者基本信息】苏州大学，劳动卫生与环境卫生学，2014，硕士
【关键词】壬基酚（NP）；生殖毒性；精子；SD大鼠；环境内分泌干扰物；

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